الکتروفورز (Electrophoresis) از دو کلمه Electro(الکتریکی) و Phoresis به مفهوم حرکت و انتقال ذره بوجود آمده است و در کل به معنی حرکت ذرات در یک مایع تحت میدان الکتریکی است
فیزیولوژی
در آزمایش های بالینی معمول تشخیص آنزیم‌های مهم موجود در سرم خون از جمله فاکتورهایی است که اغلب مورد توجه قرار می گیرد .الکتروفورز تحت شرایط خاصی قادر است این آنزیم ها را به صورت کسرهایی نشان دهد که مقادیر این کسرها بیانگر احتمال وجود صدمات مغزی ، انفارکتوس میوکارد ، انفارکتوس ریوی ، دیستروفی ماهیچه ای یا بیماری‌های کبدی هستند .
الکتروفورز چگونه کار می کند؟
الکتروفورز روشی است که در آن نمونه هایی که بار الکتریکی دارند، تحت تأثیر یک میدان الکتریکی از میان شبکه ای متخلخل حرکت می کنند. سرعت حرکت مولکول ها در این شرایط نه تنها تحت تاثیر بار الکتریکی است بلکه عواملی دیگری نظیر اندازه و شکل مولکول نیز در این امر دخیل هستند. به همین دلیل الکتروفورز روشی مناسب و کارآمد در جداسازی مولکول مورد استفاده قرار می گیرد. به طور معمول برای الکتروفورز یک مخلوط مولکولی، لایه نازکی از آن، بر روی شبکه ای متخلخل که محلولی را درون خود محبوس کرده است، قرار داده می شود. پس از برقراری میدان الکتریکی با اعمال اختلاف پتانسیل در دو سوی این شبکه، مولکول های موجود در نمونه با سرعت‌های متفاوتی درون شبکه متخلخل شروع به حرکت می کنند. این اختلاف سرعت مبنای جداسازی در الکتروفورز است. در پایان، مولکول‌های پروتئینی مختلف به صورت باندهایی مجزا در قسمت های مختلف شبکه آشکار می‌شوند.شبکه متخلخل در ممانعت از انتشار مولکول‌ها در اثر گرمای ایجاد شده به خاطر جریان الکتریکی نقش مهمی دارد.
در اغلب دستگا ه های الکتروفورز، ژل مابین دو محفظه بافری قرار می گیرد به طوری که ژل تنها واسطه در عبور جریان الکتریسیته بین این دو محفظه باشد.
اجزای دستگاه الکتروفورز
سیستم الکتروفورز از بخش های زیر تشکیل یافته است :
محفظه ، منبع تغذیه الکتریکی ، محیط پشتیبان ، معرف شیمیایی ، گرمکن ( انکوباتور ) و غلظت سنج .
محفظه الکتروفورز از دو سلول مجزا تشکیل یافته که در یکی آند ( الکترود مثبت ) و در دیگری کاتد (الکترود منفی ) قرار می گیرد. جنس الکترودهای به کار رفته معمولا گرافیت ( کربن ) یا پلاتین است .
الکترو فورز پروتئین های ادرار
الکتروفورز پروتئین های ادرار در موارد بیماری‌های اتوایمیون، بیماری های کبدی و کلیوی، التهابات حاد و مزمن در خواست می شود.
روش انجام تست الکتروفورز
برای انجام این تست ابتدا نمونه مورد نظر را که ادرار یا سرم، بنا به در خواست پزشک است به دمای اتاق رسانده و سپس مراحل انجام کار را به دقت دنبال می‌کنیم. مراحل به ترتیب زیر هستند:
۱- کاغذ استات سلولز که به صورت ژل هایی هستند که برای ۸ نمونه اغلب کاربرد دارند در بافر مخصوص به مدت ۱۰ دقیقه خیسانده می شود.
۲- بعد از ۱۰ دقیقه این کاغذ را از محلول در آورده و بین ۲ کاغذ خشک کن آرام قرار داده می شود تا نم‌گیری مختصری انجام شود ولی کاغذ نباید خشک شود.
۳-در این مرحله نمونه توسط اپلیکاتور خاصی که به منظور نمونه گذاری استفاده می شود برروی کاغذ منتقل می شود.لازم است که نمونه ها ۵/۱سانتیمتر از لبه کاغذ و حداقل ۱ سانتیمتر از کناره‌ها فاصله داشته باشند.
۴-سپس ژل را برگردانده و از پشت داخل تانک الکتروفورز که حاوی بافر مخصوص است قرار داده می شود به طوری که نمونه در سمت کاتد باشد.
۵- به وسیله ۲ لام تمیز و کاغذ صافی پلی برای ارتباط بهتر بافر با ژل تهیه می شود.
۶-تانک را به منبع تغذیه متصل کرده و با تنظیم دستگاه روی ولتاژ مناسب ( ۱۶۰ ولت) که شدت جریانی حدود ۶-۴ آمپر را فراهم کند جریان الکتریکی برقرار می شود.بعد از چند بار مصرف بافر جریان افزایش می یابد که در این زمان بافر تانک باید تعویض شده و از بافر تازه استفاده نمود.
۷- بعد از طی زمانی حدود ۲۰ دقیقه، دستگاه را خاموش کرده و مراحل رنگ آمیزی، رنگ بری، آب‌گیری وشفاف سازی انجام می شود.
۸- در نهایت باندها به وسیله اسکنر و برنامه مخصوص خوانده می شوند.
مزایای الکتروفورز
امکان جداسازی و تعیین پروتئین ها
قابلیت تفکیک زمانی و مکانی مراحل آنالیز
سهولت و ارزانی نسبی
غنای اطلاعات نهفته در داده های بدست آمده از الکتروفورز دو بعدی
الکتروفورز از شناخته شده ترین روش های آزمایشگاهی برای جداسازی بیومولکول‌ها است. این روش در سال ۱۸۰۷ توسط Reuss کشف شد. او مشاهده کرد که ذرات خاک رس تحت تاثیر میدان الکتریکی در آب پراکنده می شوند. به طور کلی الکتروفورز حرکت ذرات پراکنده در داخل مایعی تحت تاثیر یک میدان الکتریکی یکنواخت است. همین حرکت در فضایی با میدان الکتریکی غیر یکنواخت دی الکتروفورز نامیده می شود.
الکتروفورز بدین دلیل اتفاق می افتد که ذرات معلق در مایع معمولا دارای بار الکتریکی سطحی هستند و میدان الکتریکی نیروی کولونی الکترواستاتیک به این ذرات باردار اعمال می‌کند. اخیرا شبیه سازی های دینامیک مولکولی، نظریه ای بیان داشته اند مبنی بر اینکه برای انجام الکتروفورز حتما نباید ذرات بار سطحی داشته باشند و حتی ذرات خنثی نیز به علت ساختار مولکولی خاصی که آب به عنوان مایع واسط دارد، می توانند الکتروفورز شوند.
نیروی کولونی الکترواستاتیک اعمال شده به بار سطحی، با نیروهای مخالف الکترواستاتیک کاهش پیدا می کند. بر طبق تئوری لایه مضاعف، تمام سطوح بار دار در مایعات با لایه ای از بار مخالف پوشانده می‌شوند که از نظر مقداری کاملا برابر با بار سطحی است اما با علامت مخالف آن. میدان الکتریکی همانند بار سطحی به این لایه نیرو وارد می کند. مجموع این نیروها برابر است با اولین نیروی نامبرده، اما در جهت مخالف آن. در حقیقت این نیرو به یون های موجود در لایه ثانویه اعمال می شود. این یون ها در فاصله ای از سطح ذره قرار می گیرند و بخشی از این نیروی الکترواستاتیک را از طریق تنش برش سیال به سطح ذره منتقل می‌‌کنند این بخش از نیرو که به بدنه ذره وارد می شود، نیروی منفی الکتروفورتیک نامیده می شود.
یک نیروی الکتریکی دیگر نیز وجود دارد که مرتبط با انحراف لایه ثانویه است و مربوط به تقارن کروی و رسانایی سطح است و به سبب زیادی یون ها در لایه ثانویه به وجود می‌آید. این نیرو نیروی تخفیف الکتروفورتیک نامیده می شود.
تمام این نیروها با اصطکاک هیدرودینامیک، به تعادل می‌رسند و باعث حرکت ذرات در سیال می شود. سرعت این حرکت v، متناسب با شدت میدان الکتریکی E است (البته در صورتی‌که این میدان خیلی قوی نباشد.) ضریب این تناسب تحرک پذیری الکتروفورتیک است که رابطه بین شدت میدان الکتریکی و سرعت ذره را مشخص می نماید:
ماکرومولکول هایی مانند اسید نوکلئیک، DNA و پروتئین ها نیز باردار هستند و می‌توان با قرار دادن آن‌ها در یک میدان الکتریکی، بر مبنای خاصیت الکتروفورز آن‌ها را تفکیک کرد. سرعت حرکت مولکول‌ها در این شرایط نه تنها تحت تاثیر بار الکتریکی و شدت میدان الکتریکی است، بلکه عواملی نظیر اندازه، وزن مولکولی و شکل فضایی مولکول نیز در این امر دخیل هستند. همچنین اثرات محیطی نظیر نوع و نحوه استفاده از بافرها و حرارت ایجاد شده در حین کار نیز از عوامل موثر بر جداسازی مولکول‌های نمونه هستند. معمولا الکتروفورز برای تفکیک مولکول‌های بزرگی چون پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک به کار برده می شود، اما در مواردی نیز برای جداسازی مولکول‌های باردار کوچک‌تر نظیر قندها، اسیدهای آمینه، پپتیدها و حتی یون‌های ساده مورد استفاده قرار می گیرد.
در طی قرن ۲۰ میلادی چندین تئوری برای محاسبه این پارامتر به وجود آمده اند. که مهم‌ترین آن‌ها نظریه Smoluchowski در سال ۱۹۰۳ میلادی بود.
Arne Tiselius در سال ۱۹۴۸ به خاطر زحماتی که برای الکتروفورز و آنالیز جذبی کشید برنده جایزه نوبل شد و از این رو او را پدر الکتروفورز نامیدند. اولین الکتروفورز نیز الکتروفورز بدون مرز تیسلیوس نام داشت که به وسیله آن محلول های پروتئینی غلیظ را در یک تیوب U شکل بزرگ که به وسیله بافر پوشانده شده بود، مورد آزمایش قرار می دادند. این روش الکتروفورز بسیار مشکل بود، به همین دلیل در سال ۱۹۵۰ تغییراتی در عملکرد آن اعمال شد. ابتدا از فیلترهای کاغذی و استات سلولز استفاده می شد، اما به دلیل ظرفیت محدود و رزولوشن پایین این مواد، جای خود را به ژل دادند. ژل های استفاده شده در آن زمان به علت بزرگ بودن خلل و فرج ها قادر نبودند پروتئین ها را به تفکیک سایز جداسازی کنند، از این رو به تدریج به ژل هایی چون آگاروز دست یافتند.
امروزه الکتروفورز ژلی از بخش های جدا ناپذیر هر تحقیق و فعالیت های آزمایشگاهی به منظور جداسازی ماکرومولکول‌هااست. محدوده وسیعی از فعالیت های آزمایشگاهی تحقیقاتی و کلینیکی مانند تسلسل ژن ها، جداسازی کروموزوم ها، جداسازی و تعیین خصوصیات پروتئین ها توسط این روش انجام می گیرد. علاوه بر این، استفاده از الکتروفورز از مرز آزمایشگاه‌ها فراتر رفته و به عنوان شاهدی برای وکلا، قضات و هیات منصفه در امور قضایی محسوب می‌شود. تشخیص هویت DNA به خصوص در موارد تعویض نوزاد در بیمارستان ها و تعیین والدین فرد کاربرد بسیاری در علوم ژنتیک پیدا کرده است.
در حال حاضر آگاروز و پلی کریل آمید متداول ترین و پر کاربردترین ماده به عنوان واسط در الکتروفورز ژلی محسوب می شوند. در اغلب دستگاه‌های الکتروفورز، ژل مابین دو محفظه بافری قرار می گیرد به طوری‌که ژل تنها واسطه در عبور جریان الکتریسیته بین این دو محفظه باشد. هر دو شبکه خلل و فرج داری تولید می کنند که میکرومولکول‌هایی بارداری را که در پاسخ به میدان الکتریکی جابه جا می شوند در خود جای می دهند. به عنوان مثال زمانی که جریان اعمال می شود، DNA های با بار منفی به سمت الکترودهای باردار مثبت حرکت می کنند. خلل و فرج های موجود در شبکه ژلی انتقال مولکول‌های بزرگ را محدود می کنند و این در حالی است که مولکول‌های کوچک‌تر با آزادی بیشتری منتقل می شوند و در فاصله دورتری از الکترودها قرار می گیرند. این غربال مولکولی مولکول‌ها را بر مبنای سایزشان جدا می کند. همچنین می توان مولکول ها را بر مبنای بار اولیه ای که داشتند جداسازی کرد. مولکول‌هایی که بار بیشتری دارند تحرک الکتروفورزی بیشتری از خود نشان می‌دهند و سریع‌تر منتقل می شوند بدین ترتیب درون ژل با اولویت باری که داشتند قرار می‌گیرند. جداسازی بر مبنای بار به ژلی نیاز دارد که مانند آگاروز دارای خلل و فرج های بزرگ‌تری باشند. آگاروز برای جداسازی اسید نوکلئیک ها و پروتئین های خیلی بزرگ یا ترکیب ها استفاده می شود. آگاروز یک پلی ساکارید طبیعی است که از نوع خاصی جلبک دریایی قرمز به دست می آید. زمانی که گرما داده شده و سپس سرد می‌شود به صورت جامد متخلخلی با خلل و فرج های نسبتا بزرگ تبدیل می‌شود. الکتروفورز ژل آگاروز (AGE) را می توان برای جداسازی مولکول‌ها بر مبنای بار یا وزن مولکولی‌شان استفاده کرد. یکی از مهم‌ترین کاربردهای AGE جداسازی بخش های حاصل از برش DNA با آنزیم های محدودکننده است.
در طی انجام الکتروفورز ثابت نگاه داشتن حرارت اهمیت بسیاری دارد چرا که به حفظ تکرار پذیری آزمایش کمک می کند. به عنوان مثال پلیمریزه شدن آکریل آمید یک واکنش گرمازا است و گرمای حاصله به خصوص در مورد ژل های غلیظ تر، ممکن است باعث بروز بی نظمی در اندازه ی منافذ ژل شود. انتقال گرما معمولا مشکلی در ژل هایی با غلظت کمتر از %۱۵ T ایجاد نمی‌کند. البته ممکن است بالا رفتن دما مشکلات دیگری چون شکستن شیشه های الکتروفورز و آسیب به دستگاه را منجر شود. پروتئین‌ها به علت خصوصیت آمفوتری خود تحت تاثیر pH محیط بارالکتریکی خاص خود را نشان می دهند. بدین علت در جداسازی توسط الکتروفورز باید pH محلول های مورد استفاده ثابت باقی بماند. از آنجا که الکترولیز آب در آند یون‌ای “H+” و در کاتود یون‌های “OH-” ایجاد می‌کند، برای ثابت نگاه داشتن pH محلول‌های مورد استفاده، باید آن‌ها را بافر کرد.
نوع دیگری از الکتروفورز، الکتروفورز مویین (CE) است. این تکنیک که عمده ترین کاربرد آن در شیمی دارویی و درمانی است، برای جداسازی مولکول‌های درشت و ریز در مجاری بسیار نازک (با قطر داخلی ۲۰۰-۲۰میکرومتر) استفاده می شود. در این روش، جداسازی با ولتاژ بالا kV) 30-10) امکان پذیر می‌شود. از محاسن CE می توان به سرعت دستیابی به نتیجه در آنالیز یون ها اشاره کرد. به طور کلی CE بیشتر زمانی مطرح می شود که با آنالیت های باردار با پلاریته و قطبیت زیاد سر و کار داریم. این تکنولوژی در علوم بایوتکنولوژی جایگاه ویژه ای پیدا کرده و در آنالیز ماکرومولکول‌هایی چون پروتئین ها و کربوهیدرات‌ها جایگزین خوبی برای الکتروفورز سنتی به شمار می رود. همچنین تکنولوژی CE برای سرعت بخشی به رشد علم ژنتیک به خدمت گرفته شده است. استفاده از الکتروفورز موئین در علوم تحلیلی به خصوص در زمینه دارویی و زهر شناسی رشد بسیاری داشته است.
الکتروفورز موئین در بر گیرنده چندین تکنیک است که عملکرد و مشخصه های متفاوتی با هم دارند. این تکنیک ها که به مودهای الکتروفورز موئین معروف هستند عبارتند از: الکتروفورز ناحیه ای موئین (CZE)، تمرکز ایزوالکتریک (IEF)، الکتروفورز موئین ژلی، ایزوتاکوفورز (ITP) و کروماتوگرافی الکتروسینتیک موئین.
نوع دیگری از الکتروفورز که قدیمی ترین نوع این تکنیک محسوب می شود، الکتروفورز سطحی نام دارد. در این روش از یک لایه کاغذی متخلخلی با طول ۱۰-۲۰ سانتیمتر، ترموپلاستیکی متشکل از سلولز و اسید استیک و ژل پلیمر استفاده می شود.
تشخیص هویت DNA به وسیله الکتروفورز، اندازه گیری هر رشته و شمارش تعداد بخش ها و برش های تکرار شده در آن است. دانشمندان برای این کار از روش الکتروفورز ژلی استفاده می کنند. بدین ترتیب که با جریان الکتریکی رشته های DNA را از میان ژل عبور می دهند. چون هر بیت از DNA دارای بار منفی است و در معرض نیروی الکتریکی با بار برابر قرار می گیرد و آن را به سمت وجهی از ژل که بار مثبت دارد، پیش می برد. ذرات کوچک‌تر سریع‌تر حرکت می کنند. وقتی جریان برداشته می شود، از ژل تصویری گرفته می شود تا مشخص شود هر بیت چه قدر جابه‌جا شده است. با مقایسه باندهای ایجاد شده با نمونه های استاندارد که سایزهای شناخته شده ای دارند، طول هر بخش از DNA به دقت اندازه گیری می شود.
